Trình tự bộ gen của hầu hết các loại virus đã được biết đến.Đầu dò axit nucleic là các đoạn ADN ngắn được thiết kế để lai với các đoạn ADN hoặc ARN của virus bổ sung.Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật hiệu quả hơn để phát hiện virus.Các phương pháp chẩn đoán thông lượng cao đã được phát triển gần đây.
A. Kỹ thuật lai axit nucleic
Lai axit nucleic, chủ yếu bao gồm Southern blotting (miền Nam) và Northern blotting (miền Bắc), là một kỹ thuật mới đang phát triển nhanh trong lĩnh vực chẩn đoán virus.Cơ sở lý luận của thử nghiệm lai là sử dụng các đoạn ADN ngắn (được gọi là “mẫu dò”) được thiết kế để lai với các đoạn ADN hoặc ARN của virus bổ sung.Bằng cách xử lý nhiệt hoặc kiềm, DNA hoặc RNA mục tiêu sợi đôi được tách thành các sợi đơn và sau đó được cố định trên một giá đỡ vững chắc.Sau đó, mẫu dò được thêm vào và lai với DNA hoặc RNA mục tiêu.Vì đầu dò được đánh dấu bằng nuclide đồng vị hoặc không phóng xạ, DNA hoặc RNA mục tiêu có thể được phát hiện thông qua phương pháp tự ghi hoặc bằng hệ thống biotin-avidin.Vì hầu hết các bộ gen của virut đã được nhân bản và giải trình tự, chúng có thể được phát hiện bằng cách sử dụng các trình tự cụ thể của virut làm đầu dò trong mẫu vật.Hiện nay, các phương pháp lai bao gồm: dot blot, lai tại chỗ trong tế bào, DNA blotting (DNA) (Southern blot) và RNA blotting (RNA) (Northern blot).
Công nghệ B.PCR
Trong những năm gần đây, một loạt các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic trong ống nghiệm đã được phát triển dựa trên PCR, để kiểm tra các virus không nhạy cảm hoặc không thể nuôi cấy được.PCR là một phương pháp có thể tổng hợp chuỗi DNA cụ thể bằng phản ứng polymerase trong ống nghiệm.Quá trình PCR bao gồm một chu trình nhiệt gồm ba bước: biến tính, ủ và kéo dài Ở nhiệt độ cao (93 ℃ ~ 95 ℃), DNA sợi đôi được tách thành hai sợi DNA đơn;sau đó ở nhiệt độ thấp (37 ~ 60 ℃), hai đoạn mồi nucleotide được tổng hợp gắn liền với các đoạn DNA bổ sung;trong khi ở nhiệt độ thích hợp đối với enzyme Taq (72 ℃), tổng hợp chuỗi DNA mới bắt đầu từ đoạn mồi thứ 3, sử dụng DNA bổ sung làm khuôn mẫu và nucleotide đơn làm nguyên liệu.Vì vậy, sau mỗi chu kỳ, một chuỗi DNA có thể được khuếch đại thành hai chuỗi.Lặp lại quá trình này, mỗi chuỗi DNA được tổng hợp trong một chu kỳ có thể được sử dụng làm khuôn mẫu trong chu kỳ tiếp theo, và số lượng chuỗi DNA được nhân đôi trong mỗi chu kỳ, có nghĩa là quá trình sản xuất PCR được khuếch đại với tốc độ 2n log.Sau 25 đến 30 chu kỳ, quá trình sản xuất PCR được xác định thông qua điện di và các sản phẩm DNA cụ thể có thể được quan sát dưới ánh sáng UV (254nm).Vì lợi thế về độ đặc hiệu, độ nhạy và sự tiện lợi, PCR đã được áp dụng trong chẩn đoán lâm sàng nhiều bệnh nhiễm vi rút như HCV, HIV, CMV và HPV.Vì PCR rất nhạy cảm, nó có thể phát hiện DNA của virus ở mức fg, nên thao tác phải được tiến hành rất cẩn thận để tránh dương tính giả.Ngoài ra, kết quả dương tính trong xét nghiệm axit nucleic không có nghĩa là có vi rút lây nhiễm sống trong mẫu.
Với ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật PCR, các kỹ thuật và phương pháp mới được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR cho các mục đích xét nghiệm khác nhau.Ví dụ, PCR định lượng thời gian thực có thể phát hiện tải lượng vi rút;PCR tại chỗ được sử dụng để xác định nhiễm vi rút trong mô hoặc tế bào;PCR lồng nhau có thể làm tăng độ đặc hiệu của PCR.Trong số đó, PCR định lượng thời gian thực đã được phát triển nhanh chóng hơn.Nhiều kỹ thuật mới, chẳng hạn như đầu dò thủy phân TaqMan, đầu dò lai ghép và đầu dò đèn hiệu phân tử, đã được kết hợp thành kỹ thuật PCR định lượng thời gian thực, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lâm sàng.Bên cạnh việc xác định chính xác tải lượng vi rút trong dịch cơ thể của bệnh nhân, phương pháp này cũng có thể được sử dụng để phát hiện đột biến kháng thuốc.Do đó, PCR định lượng thời gian thực chủ yếu được áp dụng trong đánh giá hiệu quả điều trị và giám sát dung nạp thuốc.
C. Phát hiện thông lượng cao các axit nucleic của virus
Để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm mới phát sinh, các phương pháp phát hiện thông lượng cao khác nhau, như chip DNA (DNA), đã được thành lập.Đối với chip DNA, các đầu dò cụ thể được tổng hợp và gắn vào các chip silicon nhỏ với mật độ rất cao để tạo thành microarray đầu dò DNA (DNA) có thể được lai với mẫu.Tín hiệu của quá trình lai có thể được chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu hoặc máy quét laser và được máy tính xử lý thêm và có thể thu được bộ dữ liệu khổng lồ liên quan đến các gen khác nhau.Có hai loại chip DNA.“Con chip tổng hợp” như sau: các oligonucleotide cụ thể được tổng hợp trực tiếp trên các con chip.Một loại khác là chip hồ bơi DNA.Các gen được nhân bản hoặc sản phẩm PCR được in theo thứ tự trên trang chiếu.Ưu điểm của công nghệ chip DNA là phát hiện đồng thời một lượng lớn chuỗi DNA.Phiên bản mới nhất của chip phát hiện mầm bệnh có thể xác định hơn 1700 vi rút ở người cùng một lúc.Công nghệ chip DNA đã giải quyết được các vấn đề của phương pháp lai axit nucleic truyền thống và có ứng dụng rất rộng rãi trong chẩn đoán virus và nghiên cứu dịch tễ học.
Thời gian đăng: 23-12-2020